Gıda Örneklerinde Listeria Monocytogenes Tayini İçin Yeni Qcm Tabanlı Aptasensör Geliştirilmesi

Projede kapsamında, çalışmanın ilk aşamasında hedef bakteri L. Monocytogenes 10 farklı gıda örneklerinden izole edilen L. monocytogenes bakterileri multipleks PCR (PZR) ile karakterize edilmiştir. DNA ekstraksiyonu ardından L. monocytogenes'e özgü gen bölgeleri PZR yöntemi ile çoğaltılmıştır. L. monocytogenes özgül aptamerler adaylarının seçimi için SELEX döğüleri kullanılmış ve elde edilen dizilerin motif araması sonucunda ondan fazla anlamlı motif içeren aptamer adayları belirlenmiştir. Elde edilen aptamer aday dizileri floresan veya tiol işaretli olarak hazırlanmış ve bağlanma afiniteleri floresan yöntemle hesaplanmıştır. Daha sonra, aptamer adaylarının bağlanma kinetikleri kuarzt kristal mikrotartı (QCM) yöntemi ile yapılmıştır. Daha sonra, QCM sisteminin çipi ve manyetik ön derişim sisteminin manyetik partikülleri (Fe3O4) çift tabakalı biyo-uyumlu iki faklı polimerle kaplanması gerçekleştirilmiştir. Bu kaplama için, polidopamin (PDA) ve diaminopoliethilenglikol (DAPEG) aşılama amacı ile kullanılmıştır. Bu doğrultuda, ön deriştirme sistemi olarak kullanılmak üzere, ısı ile çöktürme yöntemi ile manyetik Fe3O4 nano-parçacıklar hazırlanmıştır ve yüzeylerinde hidrofilik özellikte çift katmanlı polimer tabakası oluşturulmuştur. Bunun için, birinci basamakta, Fe3O4 nano-tanecikleri dopamin çözeltisi içerisinde herhangi bir aktivasyon ajanına gerek kalmadan kendiliğinden polimerleşmesi sonucunda yüzeyde PDA tabakası oluşturulmuştur. Daha sonra, Fe3O4@PDA nano-parçacıkların yüzeyi ikinci bir hidrofilik polimer tabakası diaminopolietilen glikol (DAPEG) kaplanmıştır. Bu kaplama reaksiyonu için, PDA reaktif grupları ile DAPEG in serbest amin gruplarının reaksiyona girmesi ile ?Fe3O4@PDA@DAPEG? nano-tanecikler elde edilmiştir. Sensör yüzeyi de manyetik nanopartikül yüzeyine eşlenik olarak benzer yaklaşım kullanılarak hazırlanmıştır. Fe3O4@PDA@DAPEG nano-tanecikler çeşitli bakteri örnek ortamlarından ön-zenginleştirme işlemi için başarılı bir şekilde kullanılmış ve ardından elüe edilen bakteriler L. monocytogenes?e özgül aptamer içeren ÇİP@PDA@DAPEG-Apt sensörü, temas ettirilerek örneklerinden hedef bakteri L. monocytogenes?in gerçek zamanlı tespiti için kullanılmıştır. XRD verileri manyetik partiküllerin reaksiyon sonrasında yapısının bozulmadığını göstermiştir. Fe3O4, Fe3O4@PDA ve Fe3O4@PDA@DAPEG?lerinin doygunluk manyetizasyonu, sırasıyla 57,2, 40,8 ve 36,4 emu g-1 olarak belirlenmiştir. Fe3O4@PDA@DAPEG-Apt nanoparçacıkları ve ÇİP@PDA@DAPEG-Apt farklı sayıda L. monocytogenes hücresi (101 ile 1010 CFU/ml arasında hazırlanan örnekler) kullanılarak ölçümleme eğrileri elde edilmiştir. 105 bakteri hücresi PBS tamponuna ilave edilip Fe3O4@PDA@DAPEG-Apt nanopartikülleri ile teması ve eluentin QCM sensöründe frekans değişimi 3826,24 Hz olarak bulunmuştur. Eluentin plaka sayım analizinden L. Monocytogenes hücre sayısının 13696 CFU bulunmuştur Fe3O4@PDA@DAPEG-Apt nanopartiküller ortamdaki bakterilerin %90 üzerinde bir uzaklaştırma sağladığı bulunmuştur. Geliştirlen sistemin seçiciliği L. monocytogenes kıyasla diğer üç farklı Listeria suşlarının L. ivanovii (ATCC 19119), L. innocua (ATCC 33090) ve L. seeligeri (ATCC 35957) suşlarının sırasıyla %10,6, %16,1 ve %1.2 oranında QCM sinyalleri elde edilmiştir. L. monocytogenes gibi Gram pozitif bakteri olan S. aureus'un %14,2 ve B. Subtilus ise 7,5 mertebesinde sinyal ürettiği izlenmiştir. Ayrıca, gram negatif bir bakteri olan E. coli ise %0,2'si mertebesinde referans suşa kıyasla QCM den sinyal elde edilmiştir. Bu sonuçlar, geliştirilen önderişim sistemiminin ve apta-sensörün diğer bakterilere karşı da oldukça seçici olduğunu göstermiştir. Sonuç olarak, hazırlanan ön derişim sistemi kontamine olmuş L. monocytogenes patojeni tespit edecektir ve gerçek zamanlı bir bakteri analizine sahip sistemdir. L. monocytogenes için oldukça özgül bir sistemdir. Ayrıca, aptamerin değiştirilmesi ile diğer patojenlerin tayin edilmesi olanağını da sunmaktadır.